半抗原与蛋白质偶联技术.ppt

碳化二亚胺法交联原理第32页,共53页，2024年2月25日，星期天人工抗原合成方法2、含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联1）戊二醛法：双功能试剂戊二醛的两个醛基分别与半抗原和蛋白质上的氨基形成schiff键(-N=C，在半抗原和蛋白质间引入一个5碳桥。这一反应条件温和，可在4～40℃及pH6.0～8.0内进行，操作亦简便，因此应用广泛。2）重氮化法：用于活性基团是芳香胺基的半抗原，芳香胺基与NaNO2和HCl反应得到一个重氮盐，它可直接接到蛋白质酪氨酸羧基的邻位上，形成一个偶氮化合物。第33页,共53页，2024年2月25日，星期天戊二醛法合成人工抗原的原理第34页,共53页，2024年2月25日，星期天盐酸克伦特罗重氮化反应原理第35页,共53页，2024年2月25日，星期天人工抗原合成方法3、含羟基半抗原的偶联1）琥珀酸酐法；2）羰基二咪唑法。第36页,共53页，2024年2月25日，星期天人工抗原合成方法4、含巯基半抗原的偶联

1)马来酰亚胺法。2)将载体蛋白与半抗原在pH4.0的醋酸缓冲液中，通过过氧化氢的作用形成二硫键，也可以将半抗原连接到蛋白质分子上。

第37页,共53页，2024年2月25日，星期天影响人工抗原质量的因素第38页,共53页，2024年2月25日，星期天影响人工抗原质量的因素偶联比过去人们认为，联接到蛋白质分子上的半抗原数目要尽可能多。但实验证明，过多的半抗原并不能得到预期的结果，这是因为载体上覆盖的半抗原分子过多时，可能不利于载体与淋巴细胞表面结合，不能使载体引起免疫反应。研究发现各种载体的分子量不论是否接近，最佳结合比都不尽相同，并建议为了取得最佳免疫效果，应逐个确定各种载体的最佳结合比。第39页,共53页，2024年2月25日，星期天影响人工抗原质量的因素偶联桥有研究者认为，一定长度的手臂的介入，有助于半抗原暴露在外面，利于所产生抗体专一性的增强．但也有一些研究者发现，手臂结构对免疫检测经常有不利的影响，有时产生的抗体对手臂结构亲和力特别强，对待测小分子亲和力却很弱，因此造成对特异性抗体检测的干扰。可以采取两种方法来避免因偶联桥而造成的不足：一是半抗原上相同位点结合蛋白质，但免疫原和包被抗原用不同的偶联桥；二是免疫原和包被抗原用相同的偶联桥，但与不同半抗原位点结合。最好的偶联桥是3～6个直链的碳原子结构。第40页,共53页，2024年2月25日，星期天影响人工抗原质量的因素半抗原的分子空间结构用来作半抗原的分子最好有分支结构，直链分子难以产生抗体。此外，有些抗生素或农药有多个可供蛋白质偶联的位点，但据研究报道，不同位点与蛋白质结合制备的人工抗原产生的抗体效价及亲合力都有差别，这可能是因为不同位点结合导致半抗原呈现的空间结构不一样的原因。因此，如果一个分子内有多个不同的结合位点时，最好尽可能利用不同位点都合成出人工抗原，然后，通过比较，筛选出最好的人工抗原用于制备抗体作为检测。第41页,共53页，2024年2月25日，星期天半抗原的分子空间结构第42页,共53页，2024年2月25日，星期天半抗原的分子空间结构第43页,共53页，2024年2月25日，星期天半抗原的分子空间结构第44页,共53页，2024年2月25日，星期天人工抗原的质量评定第45页,共53页，2024年2月25日，星期天人工抗原的质量评定合成成功鉴定鉴定农药人工抗原最常用的方法是紫外光谱扫描法，如果人工抗原的紫外吸收图谱不同于原载体蛋白和半抗原的紫外扫描图谱，则可初步证明人工抗原合成成功。第46页,共53页，2024年2月25日，星期天紫外分光光度法测定人工抗原偶联质量第47页,共53页，2024年2月25日，星期天人工抗原的质量评定浓度测定人工抗原的绝对含量常以蛋白质的相对浓度表示（如每ml抗原溶液中含有蛋白质多少mg）。因此测定人工抗原的浓度与测定人工抗原溶液中蛋白质的相对含量（mg/ml）是一致的。常用的方法有紫外吸收法、Folin-酚法、双缩脲法、微量凯式定量法、染色结合法和荧光法等。第48页,共53页，2024年2月25日，星期天人工抗原的质量评定纯度鉴定利用吸附与分配层析和电泳技术可鉴定人工抗原的偶联的纯度。如果电泳图谱上只出现一条电泳带，则表明人工抗原达到电泳纯，否则说明人工抗原中含有未偶联的物质。第49页,共53页，2024年2月25日，星期天利用电泳技术鉴定人工抗原偶联的纯度第50页,共53页，2024年2月25日，星期天人工抗原的质量评定偶联比的测定分光光度法